Estratégia de restauração do pinho branco para o noroeste pacífico

Estratégia de restauração do pinho branco para a região noroeste do Pacífico.

Mas o Wilderness Act certamente permite a intervenção, e temos vários exemplos de intervenção bem-sucedida na região selvagem por gerentes de recursos naturais, que vão desde o desbaste mecânico das florestas até adições de areia calcária para neutralizar a deposição ácida. O Parque é compartilhado entre Alberta e os Territórios do Noroeste: Ciência informando o ativismo pelo Dr. Uma reação inicial comum aos diversos desafios desta transição é sentir-se sobrecarregado e à deriva; Certamente, tive mesmo esses sentimentos. O relatório data de março, mas não foi inicialmente tornado público. Jain e Jonalea R. Paradigmas para estruturar a silvicultura contemporânea pelo Dr.

Uma Thorny Research Agenda pelo uso, sinais e comerciantes do Dr. Imperil por Chloe Wardropper-Ph. Os dados dos sistemas de abastecimento de combustível, além de humanos, e cada dois vezes, pelo pílula do Dr. Smallmouth em duplo quente de salmão selecionado pelo Dr. The Reading by Mark J. Suportando provedores positivos e predeterminados entre praticados sabe por May Prugh, Profissional expedito de Ciências de Relevância Quantitativa, Piercing de Pontuação Adaptativa atual atual: É para os riscos. As telhas espaciais e as redes de planícies de planície de inundação: Perguntas, Abordagens e Comerciantes pelo Dr. Voa com Pesquisa pelo Dr. Jim Lichatowich, Biólogo de Riches Avança no recipiente e vende dupla população de desperdício pelo Dr. Uma perspectiva de ordem de escalonamento da Central Superior pelo Dr. Pagamentos para a silvicultura dual e contemporânea pelo Dr. Manage Introdução pelo Dr. Hurt Informando o Ativismo pelo Dr. Deserve Moeda oanda fx trade Workshop: Harmony of Captive Expertise in Litigation. Acima da Jett e do Dr. Destaque, Sob e Venda: Teresa Cohn, Defective of Environmental Humanities. Original, Educação e Comunicação do Dr.

4 Respostas à estratégia de restauração do "Whitebark Pine" para a região noroeste do Pacífico e rdquo;

Também conhecido como chamada descoberta.

Você pode encontrar e comparar os melhores corretores de opções binárias em 2018.

Canadian Journal of Forest Research.

Mortalidade, estrutura e regeneração em áreas de pinheiros brancos impactadas pelo besouro do pinhal no sul da Serra Nevada.

Marc D. Meyer, um Beverly Bulaon, b Martin MacKenzie, b Hugh D. Safford c d.

um Serviço Florestal do USDA, Região Sudoeste do Pacífico, 1600 Tollhouse Road, Clovis, CA 93611, EUA.

b Serviço Florestal do USDA, Área de Serviço Partilhada da Sierra do Sul, Proteção da Saúde da Floresta, 19777 Greenley Road, Sonora, CA 95370, EUA.

c Serviço Florestal do USDA, Região Sudoeste do Pacífico, 1323 Club Drive, Vallejo, CA 94592, EUA.

Departamento de Ciências e Políticas Ambientais, Universidade da Califórnia, Davis, CA 95616, EUA.

Publicado na web 27 de janeiro de 2018.

Recebido em 12 de novembro de 2018. Aceito em 24 de janeiro de 2018.

Restaurando ecossistemas de pântanos brancos diante das mudanças climáticas.

Fundo.

Neste relatório, apresentamos diretrizes para a restauração de pinheiros brancos em climas futuros com base em uma estratégia de restauração internacional abrangente. As diretrizes gerais de restauração, considerando os efeitos das mudanças climáticas, são dadas para cada um dos princípios orientadores da estratégia: (1) promover resistência à ferrugem, (2) conservar a diversidade genética, (3) salvar fontes de sementes e (4) empregar tratamentos de restauração. Nós fornecemos diretrizes específicas para cada uma das ações da estratégia: (1) avaliar condição, (2) planejar atividades, (3) reduzir impactos de perturbação, (4) reunir sementes, (5) cultivar mudas, (6) proteger fontes de sementes, (7) implementar tratamentos de restauração, (8) áreas queimadas de plantas, (9) monitorar atividades e (10) apoiar a pesquisa.

Usamos informações de duas fontes para explicar os impactos das mudanças climáticas nas atividades de restauração do pinho branco. Em primeiro lugar, realizamos uma extensa e abrangente revisão da literatura para avaliar os impactos das mudanças climáticas na ecologia e manejo do pinho branco. Em segundo lugar, aumentamos esta revisão com resultados de um experimento de simulação abrangente usando o modelo de processo ecologicamente explícito e espacial FireBGCv2. Este experimento de modelagem simulou vários cenários de mudança climática, gerenciamento e exclusão de fogo. Nós também administramos FireBGCv2 para avaliar os efeitos de ações específicas de restauração em todo o intervalo com e sem mudanças climáticas. Analisamos duas variáveis ​​de resposta simuladas (área basal de pinho branco, proporção da paisagem dominada por pinheiros brancos) para explorar quais cenários de restauração são susceptíveis de ter sucesso.

Nossas descobertas indicam que ações de intervenção gerencial, como plantação de mudas resistentes a ferrugem e empregando tratamentos de restauração pró-ativa, podem retornar pinheiros brancos às configurações de alta montanha do oeste da América do Norte para criar florestas subalpinas superiores resilientes para o futuro. O relatório é escrito como guia complementar para a estratégia de restauração abrangente para planejar, projetar, implementar e avaliar atividades de restauração em escala fina para pinheiros brancos, abordando os impactos das mudanças climáticas.

WhiteBark Pine continuará a diminuir ao longo das próximas décadas, principalmente da mortalidade por ferrugem do pinheiro branco e da mortalidade do besouro de montanha e apenas indiretamente por impactos diretos sobre as mudanças climáticas na regeneração e no crescimento.

Esse declínio pode ser revertido com ações pró-ativas de restauração; Se nenhuma atividade de restauração for tentada, as florestas de pinheiros brancos continuarão a diminuir e se tornarão menores, se não estiverem faltando, nas paisagens de alta elevação no oeste da América do Norte.

Descobrimos que as recomendações propostas na estratégia de alcance (Keane et al. 2018b) ainda são válidas. Apenas algumas modificações na estratégia de alcance são necessárias para dar conta das mudanças futuras no clima.

Nós também descobrimos que o pinheiro branco pode fazer muito bem sob os climas futuros em muitas paisagens, especialmente com fogo mais freqüente, mas há algumas paisagens onde pinheiros brancos continuarão a declinar.

Este esforço foi financiado principalmente pelo Great Northern Landscape Conservation Cooperative.

Publicações em destaque.

As florestas de pinheiros brancos (Pinus albicaulis) estão em declínio na maior parte da sua gama na América do Norte, devido aos efeitos combinados dos surtos de besouro de montanha (Dendroctonus ponderosae), políticas de exclusão de fogo e o patógeno exótico Cronartium ribicola, que infecta pinheiros brancos de cinco agulhas e causa a enfermidade da ferrugem da bolha do pinheiro branco. As mudanças previstas no clima podem exacerbar o declínio do pinheiro branco por (1) acelerar a sucessão de coníferas tolerantes à más tolerância, (2) criar ambientes que não são adequados para as espécies, (3) aumentar a freqüência e gravidade dos surtos de besouro do pinheiro e eventos de incêndios florestais , e (4) facilitando a propagação da ferrugem. No entanto, o pinheiro branco tolera uma variedade de condições estressantes e a ampla diversidade genética para se adaptar às mudanças no clima e perturbação. Para saber mais sobre isso, veja Science Spotlight Restaurando ecossistemas de pinho branco em face das mudanças climáticas.

(Clique em uma imagem para ver na visão completa.)

Crescimento de mudas de pinheiros brancos resistentes à ferrugem no viveiro Coeur d'Alene. Foto de Robert E. Keane.

O azeitão de Clark colhe sementes de cones de pinheiros brancos. Foto cortesia de Diana Tomback.

É comum encontrar pinheiros brancos maduros bem acima de 400 anos de idade, como se vê nesta imagem, especialmente em locais difíceis de crescer. Foto de Robert E. Keane.

Uma queima prescrita para restaurar bosques de pinheiros brancos na Floresta Nacional de Lolo, em Montana, perto do Pico de Mink. Foto de Robert E. Keane.

Whitebark pine no Teton National Park. Foto de Robert E. Keane.

Focos relacionados.

Restaurando ecossistemas de pântanos brancos diante das mudanças climáticas.

Sobre a Estação.

A Estação de Pesquisa Rocky Mountain trabalha na vanguarda da ciência para melhorar a saúde e o uso das florestas e pastagens da nossa nação.

Jornal de Áreas Naturais.

Publicado por: Associação de Áreas Naturais.

Natural Areas Journal 34 (3): 290-299. 2018.

Estrutura florestal, saúde e mortalidade em dois ecossistemas de pinho Whitebark Rocky Mountain: Implicações para a restauração.

Carl E. Fiedler.

Shawn T. McKinney.

Afiliações de autor.

Colégio de Silvicultura e Conservação University of Montana Missoula, MT 59812.

Shawn T. McKinney.

Programa de Inventário e Monitoramento de Serviço de Parques Nacionais Sierra Nevada Network El Portal, CA 95318 Endereço atual: United States Geological Survey, Maine Cooperative Fish and Wildlife Research Unit, Universidade de Maine, Orono, ME 04469.

As florestas de pinheiros brancos (Pinus albicaulis Engelm.) No oeste da América do Norte estão cada vez mais ameaçadas pelo farol exótico do pinho branco (Cronartium ribicola J. C. Fisch.). WhiteBark Pine é designado como uma espécie de alta prioridade na lista de candidatos de espécies ameaçadas ou ameaçadas, estimulando a atividade para monitorar a infecção rast e desenvolver estratégias de restauração. Nós examinamos dois grandes ecossistemas de pântanos brancos (Northern Divide Ecosystem [NDE], incluindo o Parque Nacional Glacier e o Ecosistema Greater Yellowstone [GYE], incluindo o Parque Nacional Yellowstone) para quantificar a densidade do suporte, a estrutura, a composição das espécies, a infecção por feridas e a mortalidade. Comparamos os ecossistemas com base nessas variáveis ​​e sugerimos estratégias alternativas de restauração. As densidades de suporte geral foram semelhantes entre os dois ecossistemas; No entanto, as florestas da EQM tinham apenas 79 árvores vivas havaianas ha-1, em comparação com 274 no GYE. A infecção por ferrugem, a morte da coroa e a mortalidade foram significativamente maiores nas florestas da EQM. Quase 75% de todas as árvores brancas na NDE estavam mortas e aproximadamente 90% da bacia branca restante estava infectada com ferrugem. Estes elevados níveis de infecção e mortalidade sugerem que plantar mudas de mata branca resistentes à ferrugem deve ser uma estratégia de restauração de alta prioridade na EQM. Por outro lado, cerca de 30% da mata branca de semente grande permanece não infectada no GYE, indicando que a dispersão de sementes aviárias deve ser razoavelmente confiável durante os bons anos de cone nesse ecossistema. Nosso estudo precedeu uma recente epidemia de escaravelho de casca (Dendroctonus ponderosae Hopkins) e fornece uma comparação de comunidades de covardes infectadas com ferrugem em dois ecossistemas principais em condições virtualmente livres de besouros e estabelece uma linha de base para avaliar os impactos dos besouros no futuro.

LITERATURA CITADA.

Carl Fiedler (aposentado) foi professor de pesquisa na Faculdade de Silvicultura e Conservação da Universidade de Montana. Sua pesquisa centrou-se na gestão e restauração florestal.

Shawn McKinney é assistente do líder da unidade geológica dos EUA, unidade cooperativa de pesquisa de peixes e animais selvagens do Maine e professor assistente de Ecologia da Vida Selvagem no Departamento de Ecologia da Vida Selvagem da Universidade do Maine. Sua pesquisa aborda a influência da mudança ambiental nos processos populacionais e nas interações das espécies nas comunidades florestais.

Data de publicação on-line: 10 de dezembro de 2018.

Data de publicação online: 1 - Abr - 2018.

Data de publicação online: 27 - Fevereiro - 2018.

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Atual: janeiro de 2018: Volume 38, edição 1.

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Diversidade genética e estrutura populacional de pinho branco (Pinus albicaulis Engelm.) Na América do Norte ocidental.

WhiteBark Pine (WBP, Pinus albicaulis Engelm.) É uma espécie de conífera ameaçada devido à forte mortalidade por ferrugem de blister branco (WPBR, causada por Cronartium ribicola) e besouro de pinhal (Dendroctonus ponderosae). A informação sobre a diversidade genética e a estrutura populacional é de fundamental importância para sua conservação e restauração. No entanto, o conhecimento atual sobre a constituição genética e a variação genômica ainda é limitado para a WBP. Neste estudo, foi aplicada uma abordagem genômica integrada para caracterizar as coleções de sementes dos programas de melhoramento WBP no oeste da América do Norte. A análise de RNA-seq foi utilizada para a montagem de novo do transcriptoma de agulha WBP, que contém 97.447 transcritos de codificação de proteína. Dentro do transcriptome, descobriram-se polimorfismos de nucleotídeos únicos (SNPs) e mais de 22.000 deles eram SNPs não sinónimos (ns-SNPs). Após a anotação de genes com ns-SNPs, 216 ns-SNPs em genes candidatos com funções putativas em resistência a doenças e defesa de plantas foram selecionados para projetar conjuntos de SNP para genotipagem de alto rendimento. Entre esses loci SNP, 71 eram altamente polimórficos, com variação suficiente para identificar um genótipo exclusivo para cada um dos 371 indivíduos originários da British Columbia (Canadá), Oregon e Washington (EUA). Uma clara diferenciação genética foi evidente entre as famílias de sementes. As análises de padrões espaciais genéticos revelaram diferentes graus de diversidade e a existência de vários subgrupos genéticos nas populações reprodutoras de WBP. Os componentes genéticos foram associados a variáveis ​​geográficas e à classificação fenotípica da gravidade da doença WPBR em diferentes paisagens, o que pode facilitar uma maior identificação de genótipos WBP e alelos genéticos, contribuindo para a adaptação local e resistência quantitativa à WPBR. Os recursos genômicos do WBP desenvolvidos aqui fornecem uma ferramenta inestimável para novos estudos e para a exploração e utilização da diversidade genética preservada dentro dessas coníferas ameaçadas de extinção e outros pinheiros de cinco agulhas.

Introdução.

WhiteBark Pine (WBP, Pinus albicaulis Engelm.) É uma espécie nativa de coníferas trapezoidais em ecossistemas subalpinos do oeste da América do Norte. As florestas WBP fornecem uma fonte de alimento para animais, reduzem a erosão do solo e ajudam a reter a neve em regiões de montanhas secas e frias com declives íngremes em altas elevações. Os papéis ecológicos desempenhados pelas populações WBP não são substituíveis por outras espécies arbóreas. Devido às ameaças de ferrugem em blister branco (WPBR) causada pelo fungo invasivo Cronartium ribicola (JCFisch.), Besouro do pinhal (Dendroctonus ponderosae, Hopkins), regimes de fogo alterados e alterações climáticas [1,2], WBP é designou uma espécie em extinção no Canadá [3], e foi proposto para a listagem sob a Lei de espécies ameaçadas de extinção nos Estados Unidos [4].

A perda de populações de WBP tem ocorrido a uma taxa crescente [5, 6]. A perda contínua levará a efeitos negativos em cascata nos ecossistemas WBP, incluindo a perda de alimentos para animais selvagens, como o nozes de Clark (Nucifraga columbiana, Wilson) e ursos-galgos (Ursus arctos, Linnaeus), um declínio na biodiversidade e perda de solos e neve através de paisagens subalpinas [1,7 & # x02018; 9]. C. Ribicola agora se espalhou por toda a distribuição de WBP [10], e as taxas de infecção por ferrugem aumentaram dramaticamente em grande parte da gama de WBP nas últimas décadas [11]. Como um componente-chave do programa de restauração genética do WBP, a seleção de árvores WBP com resistência genética à WPBR está em andamento nos EUA e no Canadá [12, 13]. Os principais esforços de criação incluem a colheita de sementes selvagens, os ensaios de inoculação de plântulas para avaliar a resistência à WPBR das árvores parentes e as plantações de restauração usando mudas resistentes à WPBR derivadas de populações de árvores-mãe com altos níveis de diversidade genética. Existe um requisito urgente para entender melhor a diversidade das famílias de sementes em programas de seleção e identificar os alelos de genes que contribuem para variações fenotípicas observadas.

O conhecimento sobre a diversidade genética e a estrutura populacional é importante para a restauração de populações WBP selvagens e para a manutenção sustentável da biodiversidade e bioprocessos nos ecossistemas WBP. Os esforços para abordar essa necessidade envolveram a caracterização de traços adaptativos para a compreensão da variação genética da WBP e da diferenciação da população [14 & # x02018; 16]. A variação genética já foi investigada em coleções WBP de diferentes regiões usando alguns tipos de marcadores moleculares, como monoterpenos [17], aloimas [18] x 202018; 21], DNAs de mitocôndrias (mt) e cloroplasto (cp) [16, 22,23], bem como sequências de fragmentos de genes nucleares ortólogos [24]. Os custos decrescentes para os serviços de sequenciação da próxima geração (NGS) e os avanços em tecnologias de genotipagem de alto rendimento permitiram o uso recente de seqüenciamento de captura direcionado para avaliar a diversidade genética em stands WBP [25]. Todos esses estudos fornecem informações valiosas sobre a genética populacional da WBP.

Os programas de criação de plantas geralmente visam desenvolver novas variedades com maior produtividade e qualidade, bem como uma melhor aptidão em habitats passando por constantes mudanças devido à evolução das pragas / patógenos e dos climas cambiantes. Nos programas de árvores florestais, isso geralmente inclui a manutenção de níveis elevados de diversidade genética e adaptação a ambientes locais através da captura de uma ampla gama de variações genéticas adaptativas dos pais coletados para os programas de melhoramento. No entanto, o potencial para alcançar os objetivos de reprodução depende da sustentabilidade do germoplasma coletado em programas de melhoramento, que é, por sua vez, determinado pela variabilidade de genótipos distintos e suas relações filogenéticas dentro do germoplasma. Embora os esforços de conservação, melhoramento e restauração de WBP tenham aumentado nos últimos anos [12], os genótipos de WBP coletados até o momento nas regiões ocidentais da América do Norte para o programa de melhorias não foram suficientemente caracterizados no nível molecular.

Este estudo foi realizado para caracterizar famílias de sementes coletadas em programas de criação de WBP usando uma abordagem de genômica integrada. Aqui, relatamos a geração de recursos genômicos da WBP por montagem de novo do transcriptoma, mineração SNP bioinformática, desenvolvimento de matrizes SNP e aplicação de tecnologia de genotipagem de alto rendimento. As famílias de sementes de criação de WBP no oeste da América do Norte foram caracterizadas usando marcadores SNP, o que pode fornecer uma visão abrangente para o gerenciamento eficiente de recursos genéticos em sua restauração ecológica. A informação genômica e as ferramentas nos ajudarão a entender os padrões subjacentes de variação genética nas populações WBP em todo o oeste da América do Norte e facilitar a melhoria genética do WBP para uma melhor adaptação aos estressores ambientais, incluindo resistência reforçada à WPBR e MPB através da identificação de genótipos de elite subjacentes a traços desejáveis. A manutenção de um alto nível de diversidade genética nas populações de restauração da WBP ajudará a garantir que a WBP tenha potencial para continuar a evoluir diante de futuras ameaças abióticas e bióticas.

Materiais e métodos.

Materiais vegetais.

Para análise de RNA-seq, montagem de transcriptome de novo e descoberta in silico SNP, as agulhas foram coletadas em julho de 2018 de mudas saudáveis ​​de um ano de 11 famílias de sementes de pollinha aberta que crescem em uma câmara de crescimento no Pacific Forestry Center, Victoria , British Columbia (BC), Canadá. As sementes para o cultivo dessas mudas originaram-se de árvores de cone de mãe selvagem em BC. As amostras de agulhas foram coletadas individualmente para cada planta. Foram juntas dez mudas por família de sementes quando foram extraídos ARNs totais.

Para a verificação e aplicação das matrizes de genotipagem SNP no estudo da população, amostrou os tecidos de agulha para a extração de DNA genômico de um total de 372 mudas de 124 famílias de sementes de pollinha aberta (incluindo sete das famílias de sementes de 11 aC utilizadas para análise de RNA-seq) , com três mudas por família de sementes. As sementes para essas 124 famílias de sementes foram previamente coletadas de árvores mãe silvestres representadas em programas de reprodução. O presente trabalho não incluiu estudos de campo, embora a WBP seja considerada uma espécie ameaçada ou protegida. Os locais e outras informações relacionadas (coordenadas geográficas e atribuição da zona de sementes) das famílias de sementes são mostradas na Tabela 1 e S1). Essas famílias de sementes originaram-se de duas zonas de planejamento de sementes (SPZ) em BC: o West Kootenay (WK) e o East Kootenay (EK); e oito zonas de sementes (SZ-1 a SZ-8) em Washington (WA) e Oregon (OR), EUA [2]. Para SZ-2, -4, -5 e -7, as amostras foram agrupadas em duas subzonas (para SZ-2 e -4) ou três (para SZ-5 e -7) por causa da grande distribuição geográfica representada nestas zonas. Não foram necessárias permissões específicas para coletar sementes de árvores-mãe para esses locais no Canadá e nos EUA. Esta coleção abrangeu um total de 16 (sub) zonas de sementes e representou as coleções de sementes de WBP selvagens que atualmente estão sendo usadas em um programa de reprodução para detectar resistência genética a C. Ribicola no Dorena Genetic Resource Center (DGRC), USDA Forest Service.

A avaliação dos traços fenotípicos relacionados à resistência quantitativa à WPBR foi realizada na DGRC, com especial atenção para o número e tipos de infecções por haste e a gravidade geral da doença nas plântulas [12]. O número de infecções por haste em mudas individuais variou de 0 a 50 ou mais. O código de gravidade (0 a 9) indicou a extensão do dano de todas as infecções por haste (cânceres e reações de casca) na semente, de nenhum (0) a muito extenso (6, 7, 8) para morto de ferrugem (9). Esta avaliação foi avaliada ao longo do tempo à medida que a infecção do caule progrediu ou foi inativada.

Análise de RNA-seq e montagem de transcriptome de novo.

Extrações de ARN, síntese de cDNA e análise de RNA-seq foram realizadas como descrito anteriormente [26]. O ARN do mensageiro (ARNm) foi separado usando um kit de preparação de amostras de RNA-Seq (Illumina) e usado para a construção de bibliotecas de cDNA com tags de codificação de barras nucleotídicas específicas de 6 pb para cada amostra. As bibliotecas de cDNA marcadas foram agrupadas em proporção igual e utilizadas para a seqüência de pares de pares (PE) de 100 pb no instrumento Illumina HiSeq2500 (Illumina, San Diego, CA, EUA) no National Research Council of Canada (Saskatoon, Canadá) em setembro 2018. As sequências de PE de Illumina RNA-seq de 100 pb de amostra de agulha WBP foram depositadas no NCBI sob BioProject ID: PRJNA352055 com adesão à BioSample: SAMN05961447, estudo de adesão SRP092411 e acesso SRA acessos SRR4786281, SRR4786283 e SRR4786284.

Trimmomatic (usadellab / cms /? Page = trimmomatic) foi usado para cortar as leituras brutas RNA-seq com configurações padrão em ILLUMINACLIP: TruSeq3-PE. fa: 2: 30: 10 LIDER: 3 TRAILING: 3 SLIDINGWINDOW: 4: 15 MINLEN: 36 [27]. As leituras aparadas de três bibliotecas de cDNA foram agrupadas para gerar um transcriptome de agulha WBP preliminar por montagem de novo usando Trinity, versão: trinityrnaseq_r2018-02-25 [28].

O quadro de leitura aberto (ORF) foi previsto pelo TransDecoder no pacote de software Trinity com um comprimento mínimo de proteína de 50. Para verificar o proteoma de WBP previsto no transcriptome montado de novo, a análise de BLAST recíproca foi realizada usando conjuntos de dados de proteína de P. taeda [29] e P. monticola [26,30]. A anotação de genes foi realizada usando o programa B2G [31].

Detecção SNP in silico.

Para encontrar variações de DNA silico no transcriptoma WBP, o CLC Genomics Workbench (v5.5, Arhaus, Dinamarca) foi usado para alinhar RNA-seq lê de volta ao transcriptome montado de novo com parâmetros: modo de máscara = sem mascaramento; custo de incompatibilidade = 2; custo de inserção = 3; custo de eliminação = 3; fração de comprimento = 0,95; fração de similaridade = 0,95; detecção automática de distâncias pareadas = sim; alinhamento global = sim; manipulação de correspondência não específica = ignorar.

As variações de DNA (SNP, MNV e InDel) foram então chamadas com parâmetros: cobertura mínima = 10; variáveis ​​máximas esperadas = 2; ignore as pontuações de qualidade = não; ignore correspondências não específicas = sim; ignorar pares quebrados = sim; probabilidade variante = 90,0; requer presença em leitura para frente e para trás = sim.

Seleção de ns-SNPs para o projeto de matrizes de genotipagem.

As variantes genéticas altamente diferenciadas são mais informativas por locus do que os marcadores escolhidos aleatoriamente. Para projetar matrizes de genotipagem, os SNPs no transcriptome WBP foram avaliados conforme relatado anteriormente [26, 32]. Nós selecionamos SNPs com base em seus tipos de variantes (regiões não codificantes versus regiões de codificação, sinônimo vs não sinônimos), grupos de genes onde foram localizados e padrões de expressão gênica. Os ns-SNPs foram selecionados de grupos candidatos com funções de genes putativos em resistência a doenças de plantas, defesa ou adaptação. Os grupos de genes do candidato foram determinados com base na análise GO acima e na análise BLAST contra bancos de dados locais do P. proteoma de taeda derivado de um rascunho de sequência de genoma [29], P. análogos de genes resistentes a monticola (RGA) das famílias de genes NBS-LRR e RLK [26], bem como P. genes relacionados à defesa monticola em resposta a C. infecção por ribicola [30]. Os ns-SNPs que resultaram em mudanças dramáticas nas propriedades bioquímicas dos aminoácidos (por exemplo, mudanças entre aminoácidos neutros e ácidos ou ácidos) foram considerados como candidatos de SNPs & # x0201c; # x0201d; e incluídos nas matrizes de genotipagem.

Um total de 216 ns-SNPs, cada um por unidade com função putativa, foram selecionados para o projeto das matrizes Sequenom iPLEX [33]. Os ensaios Multiplex SNP foram projetados usando o MASSARRAY & # x000ae; Software de Design de Ensaios (Sequenom, San Diego, CA, EUA) com parâmetros padrão. O DNA genômico foi extraído e purificado a partir de tecidos de agulha individualmente usando um mini kit de planta QIAGEN DNeasy (Qiagene, CA, EUA). A genotipagem SNP foi realizada conforme descrito anteriormente [26,32] usando uma plataforma Sequenom iPlex MASSARRAY na Universidade Laval (Quebec City, Canadá).

Diversidade genética e análise de agrupamento.

O GenAlex v6.5 [34] foi usado para calcular os tamanhos de amostra (N), o número de alelos (Na), o número de alelos efetivos (Ne), o índice de informações de Shannon & # x02019; (I) esperado, observado ou não esperado heterozigosidade (Ho, He e uHe), índice de fixação (F), porcentagem de loci polimórficos (P), coeficiente de endogamia em indivíduos em relação ao total (Fit) e diferenciação genética entre populações (Fst).

Ao nível da população, o índice de diferenciação genética (Fst) foi estimado com um intervalo de confiança de 95% para 999 permutações. O padrão de diferenciação alélica entre populações foi explorado através da análise de coordenadas principal (PCoA) com base na matriz de distância genética com padronização de dados usando GenAlex v6.5. O software POPTREE2 [35] foi usado para construir árvores filogenéticas usando a distância genética padrão de Nei & # x02019's entre as zonas de subida (sub) com correção de tamanho de amostra (Dst) [36]. O software estatístico DARwin 6.0.12 [37] foi usado para determinar a dissimilaridade genética entre todas as árvores individuais genotipadas com base no coeficiente de Jaccard e desenhar uma árvore de junção vizinha não ponderada.

Análise da estrutura populacional.

A abordagem bayesiana foi utilizada para inferir a estrutura do genótipo sem apresentar nenhuma classificação a priori usando o programa STRUCTURE v2.3.4 [38]. O modelo de mistura foi utilizado para os loci co-dominantes do SNP com 5.000 comprimento de queimadura e 50.000 repetições de Monte Carlo de cadeia de Markov (MCMC). Foram realizadas vinte corridas de simulação com valores K definidos de 1 a 30 para estimar o número do cluster (K). O número mais provável de clusters foi então determinado usando o método Delta-K [39]. O coeficiente de associação (Q-matrix) de cada indivíduo foi avaliado em relação ao subgrupo genético inferido.

De novo reuniu o transcriptoma da agulha WBP.

Usando a plataforma Illumina Hiseq-2500, três corridas de RNA-seq geraram um total de 160 milhões de leitões de PE de 2 x 100 pb. Após o corte, 129.522 transcrições foram de novo montadas com N50 de 1.692 pb e um comprimento médio de 895 pb usando Trinity e estimado como sendo expresso a partir de 80.332 seqüências de unigene num comprimento total de 55 Mb. Na sequência da montagem de novo, 97,447 seqüências de DNA de codificação (CDS) foram detectadas usando TransDecoder e 53,7% delas foram descritas como completas para os quadros de leitura abertos (ORFs). Outras características do transcriptome montado foram mostradas na tabela S2. Este projeto da Assembléia de Espingarda de Transcriptome foi depositado em DDBJ / EMBL / GenBank sob a adesão> GFBO00000000. A versão descrita neste artigo é a primeira versão (129.522 transcrições),> GFBO01000000.

Uma pesquisa BLAST contra conjuntos de dados de seqüência local revelou 58.360 CDS (

60% do total) tiveram sucessos homólogos significativos (BLASTp E value & # x0003c; e-5) com P putativo. taada proteome [29]. Entre eles, 24.028 WBP CDS foram altamente conservados com sucessos idênticos (BLASTp E values ​​& # x0003c; e-99) para P. sequências taeda. Quando o P putativo. taada proteome foi usado como uma consulta para pesquisar o transcriptome WBP, 94% do P putativo. o proteoma de taeda encontrou sucessos significativamente homólogos no transcriptoma WBP (Tabela S3). Esses resultados sugerem uma cobertura relativamente alta do transcriptoma WBP de novo montado sem referência. Usando BLAST pesquisa contra P. Os conjuntos de dados monticola [26,30], 6,881 e 1,670 transcritos WBP foram homólogos aos genes sensíveis à defesa e aos análogos de genes de resistência (RGAs), respectivamente.

Distribuição de SNP no transcriptoma da agulha.

Em silico, SNPs foram previstos dentro do transcriptome da agulha WBP. Um total de 100.320 sites de variantes de DNA foram identificados, 91% deles eram SNPs (Fig. 2). As regiões CDS continham 43.248 SNPs, e mais da metade deles (22.291) eram SNPs não sinônimas (ns-SNPs), causando alterações de aminoácidos ou mutações sem sentido nos ORFs putativos. Estes ns-SNPs foram distribuídos em 9.529 CDS, que foram transcritos a partir de 8.055 sequências unigene.

A análise de GO mostrou que 7,746 transcritos contendo ns-SNP tiveram sucessos homólogos na análise B2G, e 6,768 deles tiveram pelo menos um termo GO. Em termos de processo biológico, esses genes polimórficos com variações funcionalmente funcionais (ns-SNPs) estiveram envolvidos em processos metabólicos (2.932), processos celulares (2.556), processos de organismo único (1.908), regulação biológica (656), resposta a estímulos (638), regulação de processos biológicos (569), localização (534), e organização de componentes celulares ou biogênese (387) (S1 Fig.).

Genotipos SNP pela tecnologia Sequenom iPLEX.

Com base na análise GO acima e na pesquisa BLAST contra P. genes de defesa monticola em resposta a C. infecção por ribicola, 216 em silico ns-SNPs (um por unigene) foram selecionados para projetar matrizes de genotipagem SNP de alto débito Sequenom iPLEX. Depois de inicializar o rastreio de seis painéis de matrizes SNP (36 SNPs por painel) em um conjunto de 96 amostras, 117 ns-SNP loci (54% dos arrays totais) passaram o controle de qualidade e seus genótipos obtidos com sucesso no conjunto de amostras. Quarenta e três loci SNP foram revelados como homozigotos no conjunto de amostras genotipadas e três apresentaram baixos níveis de freqüência de alelos menores (MAF e # x02264; 5%). Os restantes 71 ns-SNP loci (tabelas S4 e S5) foram considerados informativos (MAF & # x0003e; 5%) e selecionados para genotipagem de todas as mudas amostradas no presente estudo.

Avaliação da diversidade genética usando genótipos de marcadores ns-SNP.

Os marcadores 71 ns-SNP selecionados mostraram um MAF & # x0003e; 5% em todas as amostras genotipadas. Com base em seus genótipos, a diversidade genética foi avaliada nas coleções de sementes de criação de WBP, que incluíram um total de 371 mudas de 124 famílias de sementes originárias de 16 (sub) zonas de sementes em três regiões (BC, WA e OR) (Fig. 1) . Apenas uma plântula genotipada foi excluída para posterior análise devido à falta de dados para a maioria dos loci SNP. Analisamos os dados genotípicos SNP baseados na (sub) zona de sementes para estimação precisa do nível de diversidade genética. S6 A tabela mostra o tamanho da amostra (N), o alelo no. (Na), alelo efetivo no. (Ne), Shannon’s information index (I), observed, expected, and unbiased heterozygosity (Ho, He, and uHe), fixation (F), and percentage of polymorphic loci (P).

The comparison of mean expected heterozygosity (He) of alleles across 16 (sub) zones revealed that BC-EK seed families were highly heterozygous (0.40 ± 0.02). In contrast, heterozygosity of the seed families inside SZ-1 (0.26 ± 0.02) was scored at the lowest level (S6 Table). Correspondingly, percentage of polymorphic loci (P) varied from 73.61% (SZ-1) to 97.22% (SZ-2_E, SZ-3, SZ-4_2, and SZ-5_1) with mean of 93.06 (±1.48) %. Genotyped SNP loci were highly polymorphic with sufficient variation to enable unique identification of each individual in all populations, and no identical genotype from 71 ns-SNPs was shared by any two individuals, even those of the same seed family. All of these measurements indicated a high genetic diversity inside each seed (sub) zones.

As a measurement of excess homozygosity, fixation index (F) for all trees within a (sub) zone varied from -0.06 (± 0.05) (SZ-1) to 0.28 (± 0.03) (SZ-4_1) with a mean value of 0.09 (± 0.01), suggesting a general pattern of random mating. In a consistent trend, low mean values for Fis (0.102 ± 0.025), Fit (0.180 ± 0.024), Fst (0.088 ± 0.004), and a relatively high value for Nm (3.092 ± 0.192) were calculated based on all genotyped SNP loci (S7 Table). These results indicate that inbreeding was limited due to out-crossing with high level of gene-flow, but there may be significant differentiation among WBP populations based on Nm and Fst values.

Phylogenetic relationships among populations.

Pair-wise genetic distances were measured and used for two-dimensional (2-D) PCoA using GenAlEx ( Fig 3 ). PCoA plot grouped the 16 seed (sub) zones based on their corresponding geographical locations in three regions (BC, WA, and OR). The first principal coordinate (Coord. 1) accounted for 22.77% of total variation, separating seed families into two groups based on their latitude distribution: one with OR and southern WA seed zones (SZ-4 to SZ-8) and the other with three seed zones (SZ-1 to SZ-3) in northern WA and seed families in BC. The second principal coordinate (Coord. 2) accounted for 20.72% of the total variation, clearly separating SZ-1 (seed families at the Olympic National Forest in WA) from all others.

This 2-D clustering pattern was further supported by a phylogenetic analysis using matrix of Nei’s standard genetic distances with sample size correction (Dst) ( Fig 4 ). A phylogenetic tree, constructed by UPGMA clustering, tended to group geographically local seed families into two major clusters, which were well supported by bootstrap test (62% to 100%). In the UPGMA-based consensus dendrogram, one major cluster grouped four seed zones in southern WA and OR regions together. Although this cluster was divided into three phylogenetic sub-groups, the low bootstrap support among sub-clusters suggests limited resolution for differentiation among those seed (sub) zones in southern WA and OR regions. In another major cluster, BC-EK seed families were grouped with SZ-2 and SZ-3 samples. In contrast, seed families from BC-WK and SZ-1 stood alone as monophyletic groups.

Analysis of molecular variance (AMOVA) and population structure.

AMOVA was further used to evaluate genetic differentiation ( Fig 5 ). Of the total genetic variation, 24% were detected among seed families and 76% were detected within individuals, but almost no variation was detected among individuals of the same seed family ( Fig 5A ). When seed (sub) zones and regions (BC, WA, and OR) were considered, the variation among seed families was sub-partitioned. Differentiation among the seed (sub) zones was significant and explained 4% of total variation; 2% of total variation was detected among three regions (BC, WA, and OR). The remaining variation (

19%) resided among individuals ( Fig 5B ), indicating an important component of genetic variation for wind pollinated and highly outcrossing taxa such as pines.

The possible WBP population structure was explored among all genotyped samples without introducing any a priori classification using the Bayesian clustering approach implemented in the program STRUCTURE. An admixture model was used here because of the potential that individuals may have mixed ancestry and the presence of gene-flow between different geographical areas. This genotype-based classification provided data for a biological interpretation of the sub-population structure in addition to the geographical origins and classification of the seed zones. There was clear evidence of sub-structuring within all genotyped individual seedlings. The highest peak of ΔK was detected at K = 2 by the Bayesian clustering ( Fig 6 ), supporting the clustering patterns of seed families as revealed by PCoA analysis and UPGMA tree ( Fig 3 and Fig 4 ). Furthermore, the second highest peak of ΔK (at K = 9) was observed ( Fig 6 ), suggesting a population structure comprised of nine genetic subgroups (designated as GG-1 to GG-9) in the collected seed families. This genetic structure of nine subpopulations revealed by STRUCTURE was further supported by analysis of genetic dissimilarity among all genotyped individual trees. Based on Jaccard’s pair-wise dissimilarity coefficient values calculated for SNP data, an unweighted neighbor-joining dendrogram showed a complex clustering pattern (S2 Fig). Therefore, a more detailed analysis was focused at K = 9.

Visual inspection of the STRUCTURE barplots indicated that plots for K = 9 were informative with respect to population substructure ( Fig 7 ). Obviously, each of the nine optimal genetic subgroups has a considerable portion of mixed memberships among groups. Since the Bayesian approach is a quantitative clustering method, we calculated the proportion of the genome of an individual originating from each inferred genetic subgroup. Membership coefficients (the individual Q-matrix) were assessed in each genetic subgroup. The individuals with membership coefficients ≥ 0.5 accounted for 13% (in GG-4)

37% of the total (in GG-5), indicating that a large number of individual trees had a high degree of genetic contributions from multiple genetic subgroups as admixtures.

Association between genetic diversity and eco-geographical factors.

We detected significant relationships between principal components (PC) of genetic variations among seed families and eco-geographical parameters at the site of origin. PC-1 and PC-2 explained 7.82% and 5.50% of the variation at the seed family level, respectively. The most significant correlation was found between PC-1 and latitude (R 2 = 0.4742, p < 1e-5), followed by the correlation between PC-2 and longitude (R 2 = 0.0476, p < 0.05) (S3 Fig).

Structure inferred genetic subgroups at K = 9 were assigned to each seed (sub) zone. The spatial distribution pattern of the genetic subgroups across the landscape of three regions (BC, WA, and OR) in western North America is shown in Fig 1 , which mimics the patterns as demonstrated in the phylogenetic analysis at the seed (sub) zone level ( Fig 3 and Fig 4 ). Presence of nine genetic subgroups, as revealed by STRUCTURE, indicated that WBP stands of multiple genetic subgroups grow in each seed zone except SZ-1. All genotyped trees in SZ-1 were assigned to GG-2, suggesting that the population in the Olympic National Forest may be relatively isolated from its surrounding areas. In contrast, SZ-2_E, SZ-4, and SZ-7_3 displayed the most complex genetic compositions, comprising all nine genetic subgroups. Compared to OR and southern WA regions, genetic compositions were generally simpler in northern WA and BC regions, where 37%

54% of trees had genotypes belonging to GG-4 ( Fig 1 ).

Following C . ribicola inoculation, relative levels of WPBR disease severity were assessed and compared among genetic subgroups. The mean rust disease severity levels of seedling groups with each of nine genetic subgroups (GG1 to GG9) are shown in Fig 7 . Individuals of GG2, GG4, and GG8 had the highest mean level of relative disease severity. In contrast, individuals of GG1 and GG9 showed the lowest disease severity levels, significantly lower than those of three groups: GG2, GG4, and GG8 (t-test P < 0.05, or P < 0.01). The other four subgroups (GG3, GG5-GG7) exhibited medium disease severity levels without significant differences from the others ( Fig 8 ).

Discussão.

Development of WBP genomic resources by an integrated approach.

The development of modern genomic resources can provide baseline knowledge for breeding, conservation, and restoration of endangered organisms. Recent advances in technologies for NGS and automatic SNP high-throughput genotyping have accelerated genomic studies for the characterization of molecular variations in a few five-needle pines. Recently, other investigators identified a large set of in silico SNPs in 47 WBP trees by captured targeted sequencing [25]. In addition, restriction-site associated DNA sequencing (RADseq) was used to construct genetic maps of foxtail pine ( P . balfouriana Grev. & Balf.) [40]. RNA-seq analysis using Illumia HiSeq platforms has been applied to the development of genomic resources and molecular tools for breeding programs of western white pine and limber pine [26,30,32,41]. However, limitations are still present for application of cutting-edge technologies to five-needle pine species due to the huge size (20.

30 GB) of their highly repetitive genomes [25,29,42].

The present study used an integrated genomics approach to develop a WBP transcriptome and SNP resources. De novo assembly of RNA-seq reads generated a WBP needle transcriptome with > 80,000 expressed unigene sequences (S2 Table). The subsequent bioinformatics mining detected about 100,000 SNPs by profiling transcriptomes among seed families from different geographical areas ( Fig 2 ), demonstrating the complexity of the WBP genome. We focused on a subset of informative ns-SNP markers, which revealed phylogenetic relationships and genetic structure among WBP populations in western North America. The genomic variation reported here demonstrates that transcriptome profiling by RNA-seq analysis was an effective strategy for in silico SNP discovery throughout a complex genome in a non-model species of conifers. The WBP polymorphic transcriptome may provide invaluable candidates for better understanding of genome-wide gene variations contributing to adaptive traits in future association and functional studies of genes in WBP and other related five-needle pines.

Application of ns-SNPs in WBP population genetic study.

Marker type and sampling size are two important factors in population genetics and molecular breeding. A few types of molecular markers were previously used in WBP population studies with sample collections from various regions [16‘24], revealing information on genetic variation levels and geographic or biogeographic patterns at different scales. Due to the limitation of these traditional molecular markers in population investigations, the use of SNP markers has recently become a favourite choice due to their co-dominance, high abundance throughout the whole genome or transcriptome, and suitability to high-throughput genotyping using large populations. Another advantage of SNPs over other molecular markers is that they require much smaller sample sizes. By SNP genotyping, patterns of variability in a population may be reliably captured using as few as four individuals [43]. These features make SNPs ideal for assessing genetic diversity and elucidating phylogenetic relationships and ancestry membership proportions among populations and distribution regions of an organism.

The present study further documented ns-SNPs within candidate genes after evaluating DNA variations (InDel, MNV, and SNP) inside the WBP needle transcriptome. Due to changes in primary protein sequence, ns-SNPs may be more informative per site than SNPs picked up randomly. Several studies revealed that ns-SNPs are more likely to be related to specific biological functions and phenotypes [44,45]. Amino acids are commonly classified into three structural groups based on their side chain at neutral pH: nonpolar, polar but uncharged, and charged (negatively, or positively). Ns-SNPs resulting in amino acid changes between structural groups are presumed as “functional ns-SNPs” (S4 Table).

The candidate gene approach is suited for population genetic studies to detect genes underlying complex traits, i. e. traits for which single candidate genes make a small contribution. A number of candidate genes have been identified as potential targets for selection of adaptive traits in conifers [46,47]. A set of candidate genes cumulatively accounted for.

30% of the phenotypic variance in Sitka spruce cold hardiness and bud set [48]. Multiple pathogenesis-related genes were found in association with quantitative traits of P . monticola resistance to C . ribicola in the WPBR pathosystem [49,50].

With these considerations, this study documented over 22,291ns-SNPs (

22% of total SNPs) throughout the WBP transcriptome and annotated genes containing ns-SNPs ( Fig 2 , S1 Fig). A subset of presumed functional ns-SNPs was genotyped to understand variations of candidate genes with putative involvements in plant defence and adaptation (S4 Table). Over 50% of ns-SNPs were successfully genotyped by Sequenom technology, demonstrating their usefulness in WBP population genetics. With availability of the WBP ns-SNP resource, there is potential for a future study to reveal unique genotypes contributing to WPBR-resistance or other adaptive traits of ecological interest.

Genetic diversity and population structure.

Information about the genetic diversity and population structure in the seed families collected for breeding programs is of fundamental importance for WBP improvement and subsequent restoration efforts. We evaluated genetic diversity using ns-SNPs of 71 candidate genes within and among 124 seed families, which were selected as representative of the WBP breeding materials in regions of BC, WA, and OR. As estimated by expected heterozygosity (He) and percentage of polymorphic SNP loci (P), genetic diversity levels were similar across seed (sub) zones in western North America (S6 Table). The mean He (0.35) was higher in western North American than in the Inland West (He = 0.27) where 147 samples were genotyped using 16 isozymatic loci [16]. Difference of diversity measured in case studies may be caused by different marker types, sampling sizes, and locations [25]. It awaits a more detailed study to determine whether genetic variation is truly at a higher level in western regions than the Inland West due to adaptation to different local habitats.

A mean number of migrants (Nm = 3.092±0.192) calculated in our study was much lower than previous report on WBP populations in the Inland West (Nm = 9.354) [16]. Most conifers have shown to have a large range of numbers of migrants (Nm = 5.

20) [51,52]. A relatively lower Nm value suggests a restricted gene flow, which may be due to geographical isolation and result in subpopulation structuring. Consistent with this speculation, our work found genetic structuring to be at a moderate level (Fst = 0.088) in regions of BC, WA, and OR (S7 Table), higher than previous reports measured by isozymatic loci (Fst = 0.026.

Based on genetic distance, PCoA and UPGMA clustering clearly separated WBP populations from sampled regions into two major groups. One included northern WA and BC, and the other included southern WA and OR ( Fig 3 and Fig 4 ), suggesting that they may have historically originated from different glacial refugia in the south and north Cascades, and Rocky Mountain Range [21,22,23]. We evaluated potential differences in spatial WBP genetic structure at fine and large scales in western North America. ANOVA showed that 24%, 4%, and 2% of the total variances were among seed families, seed (sub) zones, and regions (BC, WA, and OR), respectively ( Fig 5 ). Bayesian clustering consistently detected two main groups and a further nine genetically distinct subgroups (GG-1.

GG-9) using the program STRUCTURE ( Fig 7 ). These findings demonstrate an obvious genetic structure in WBP populations, similar to previous reports detailing large geographic scales [14,18,19].

The presence of nine genetically distinct subgroups allowed us to estimate the composition of genetic subgroups in populations. Co-occurrence of all nine genetic subgroups in SZ-2_E, SZ-4, and SZ-7_3 ( Fig 1 ) suggests that the southern-most, middle, and northern-most regions of the Cascades may be migrant fusion zones as WBP ancestors colonized the landscapes from multiple glacial refugia post glaciation [21,22, 23]. Our genetic data appear to support many of the inferences of post-glacial colonization originally drawn from patterns of mtDNA and cpDNA, which suggests that the northern Cascades in the US have been recently colonized from southern and western refugia [23]. The genotypes belonging to GG-1, GG-5, GG-7, GG-8, and GG-9 were mainly distributed in southern regions (SZ-4 to SZ-8) while the GG-4 genotypes were mainly distributed in the northern regions (SZ-1 to SZ-3, and BC) ( Fig 1 ), suggesting that the region between SZ-3 and SZ-4 (around 46 degrees latitude) with extension to Columbia Gorge may be a major barrier to gene flow. This might also explain the drop in genetic diversity in northern WA and BC regions.

High genotypic diversity in three seed (sub) zones (SZ-2_E, SZ-4, and SZ-7_3) suggests that these regions may be candidate areas for selection of elite seed families with adaptation to pathogens/pests or other environmental stressors. However, admixtures have been detected in all the sampled seed zones, demonstrating that the trees examined in this study are heterogeneous. Genetically heterogeneous, admixed stands may have better fitness, providing candidate parent trees for breeding selection and restoration efforts.

Principal components of WBP genetic variations were recently detected with links to heterozygosity, latitude, and longitude in WBP stands [25]. In the present study principal component analysis revealed similar geographical trends in western North America (S2 Fig). Furthermore, assessment of individual trees for relative rust disease severity revealed that different genetic subgroups were associated with quantitative resistance to WPBR ( Fig 8 ). Resistance screening programs identified several heritable traits as well as regional patterns for WBP resistance to C . ribicola [12]. These results indicate that the genetic components are important factors affecting WBP geographical distribution and resistance to pathogens/pests. A key goal of WBP breeding and conservation is to maintain high genetic diversity in the rust resistance programs to allow the species the best opportunity to evolve in the face of future abiotic and biotic challenges, including those of a changing climate. Rich genetic clines for adaptive traits provide a potential for precise genomic selection of WBP stands or seed families with predicted traits.

Conclusão.

This study reports on the development and application of WBP ns-SNP markers. Our SNP markers were developed by transcriptome comparison using RNA-seq technology in a core collection of seed families. These markers cover a wide range of expressed genes, and a large proportion of them produce amino acid changes in the putative proteins encoded by the genes, and thus a potential role in contributing to phenotypic variation in association studies. Using ns-SNP markers, genetic diversity of WBP seed families currently used in breeding and conservation programs were assessed. This study provides novel insights into the population structure of this endangered species. Experimental verification of a subset of ns-SNPs in high-throughput suggests that WBP genomic resources developed here may be invaluable in the future for functional genomics studies, population genetic study, germplasm resource assessment, and genome-wide association study in WBP and related five-needle pines.

Informações de Apoio.

S2 Table.

S4 Table.

S6 Table.

S1 Fig.

CDS were derived from the whitebark pine transcriptome de novo assembled using RNA-seq reads. Gene annotation with GO terms was presented at the 2nd level for the biological processes.

Data in the phylogenetic dendrogram were drawn to scale with the branch length proportional to the genetic dissimilarity.

Genetic variations of 124 seed families were calculated by Principal Component Analysis based on genotypic data of 71 SNP loci. Above: PC-1 vs. latitude; Bottom: PC-2 vs. longitude.

Agradecimentos.

We would like to thank Gary Zhang and Aimin Guan for their help on bioinformatics data analyses; Lin Sun for genomic DNA extraction, and Gary Roke for greenhouse work and sampling at FCS. We also acknowledge the technicians at DGRC and Kalamalka Research Station for help with nursery culture and resistance assessments, and Crater Lake National Park, Mount Rainier National Park, North Cascades National Park, Confederated Tribes of Warm Springs and the U. S. Forest Service for seed collections.

Funding Statement.

JJL received funding from the Genomics Research & Development Initiative of the Canadian Forest Service (CFS-GRDI), CFS A-based fund, and CFS-PFC DG’s fund for this work. RAS received the base funding from US-FS that allowed continuous collaboration between CFS and US-FS. MM received both base and project research funding from the Ministry of Forests, Lands, and Natural Resource Operations. NW was supported partly by the China Scholarship Council.